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午後4時30分頃からは、『ザ・ベストワン』が放送される。MCは笑福亭鶴瓶と今田耕司。漫才からコント、ピン芸、音ネタまで、今一番見たいベストな芸人が“ベストワン”のネタを披露する番組だ。2020年の『お笑いの日』初回から3年連続で同じ時間に笑いを届ける。
今回、ベストワンのネタを披露する出演芸人が決定。年に一度の『お笑いの日』ということで、超豪華なメンバーが揃った。
漫才を披露するのは、爆笑問題、おぎやはぎ、『M-1グランプリ』王者のNON STYLE、霜降り明星、さらにいま人気急上昇中のニューヨーク、見取り図。コントを披露するのは、『キングオブコント』王者の空気階段、ジャルジャル、ハナコ、シソンヌ、さらに小堺一機と関根勤のコンビ・コサキンが『お笑いの日』初出演でネタを披露する。また、漫才に3つのお題を即興で盛り込み披露する「ザ・ベストワンテイク」には、『M-1グランプリ』王者の錦鯉、マヂカルラブリーが挑戦する。
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